TEMA: Pérdida del anclaje GPI en Leucemia Linfoblástica B por regulación epigenética descendente de la expresión de PIGH
MECANISMO EPIGENÓMICO TRATADO: Silenciamiento del promotor PIGH mediante metilación, lo cual determina que no se exprese el anclaje glucófosfatidilinositol (GPI) esto incide en que tampoco se exprese en la membrana CD52, contribuyendo al desarrollo de resistencia al tratamiento con alemtuzumab (ALM) en pacientes con B-ALL.
CÓMO SE REALIZÓ:
1. Se utilizaron muestras residuales de Médula Ósea o Sangre Periférica de pacientes sin tratamiento previo con ALM en B-ALL, leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia de células pilosas (HCL) o linfoma de células del manto (MCL) que se tomaron en el momento del diagnóstico. Como mecanismo de control se utilizarón células B normales.
2. Las células mononucleares (MNC) se aislaron mediante separación Ficoll-Isopaque y se crioconservaron en los medios de Dulbecco modificados de Iscove, suplementados con suero de ternera fetal al 25% y dimetilsulfóxido al 10%.
3. Mediante análisis citométrico de flujo se indentificó que las células B negativas de anclaje a GPI carecían constantemente de expresión de membrana CD52. Además se demostró que las células B negativas de anclaje a GPI estaban presentes en el tumor maligno (CD45dim) pero no en las células B normales, ni en ninguna otra neoplasia que no sea B-ALL.
4. Para examinar si la pérdida de expresión de ARNm de PIGH de los subcultivos negativos a anclaje GPI era resultado de delección genómica de las 10 kb de PIGH , se realizó la PCR utilizando cebadores diseñados para amplificar la región genómica completa; también se realizó secuenciación de Sanger de 630 pb de la región promotora del gen PIGH. Y en ambos casos no se detecto delecciones, inserciones o mutaciones genómicas.
5. Mediante análisis de curva de fusión específica de metilación (MS-MA) y secuenciación de Sanger se mostró altos niveles de metilación en la región (CpG −11 a −6), lo que implicaría que los CpG en esta posición son esenciales para la regulación de la transcripción PIGH.
6. Se trató a los subcultivos negativos de anclaje GPI con el agente desmetilante 5-aza y se observó el restablecimiento de la expresión de anclaje GPI.
RESULTADOS:
La presión selectiva proporcionada por el tratamiento con ALM puede dar lugar al crecimiento de variantes de escape GPI / CD52 negativas en pacientes con LLA-B, debido a que la pérdida de la proteína CD52 anclada a GPI hace que las células sean resistentes al anticuerpo terapéutico de ALM dirigido a CD52. Esta situación puede revertirse con un tratamiento adicional de 5-aza-2'-desoxicitidina que inhibe a la Enzima Metil-Transferasa de ADN (DNMT), aumentando la efectividad del tratamiento con ALM y reduciendo el alto índice de recaídas.
REFERENCIAS:
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/ajh.25337
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