Terapia Epigenética en Leucemia Linfoide Aguda

TEMA: Pérdida del anclaje GPI en Leucemia Linfoblástica B por regulación epigenética descendente de la expresión de PIGH

MECANISMO EPIGENÓMICO TRATADO: Silenciamiento del promotor PIGH mediante metilación, lo cual determina que no se exprese el anclaje glucófosfatidilinositol (GPI) esto incide en que tampoco se exprese en la membrana CD52, contribuyendo al desarrollo de resistencia al tratamiento con alemtuzumab (ALM) en pacientes con B-ALL.

CÓMO SE REALIZÓ:

1. Se utilizaron muestras residuales de Médula Ósea o Sangre Periférica de pacientes sin tratamiento previo con ALM en B-ALL, leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia de células pilosas (HCL) o linfoma de células del manto (MCL) que se tomaron en el momento del diagnóstico. Como mecanismo de control se utilizarón células B normales.

2. Las células mononucleares (MNC) se aislaron mediante separación Ficoll-Isopaque y se crioconservaron en los medios de Dulbecco modificados de Iscove, suplementados con suero de ternera fetal al 25% y dimetilsulfóxido al 10%.

3. Mediante análisis citométrico de flujo se indentificó que las células B negativas de anclaje a GPI carecían constantemente de expresión de membrana CD52. Además se demostró que las células B negativas de anclaje a GPI estaban presentes en el tumor maligno (CD45dim) pero no en las células B normales, ni en ninguna otra neoplasia que no sea B-ALL.

4. Para examinar si la pérdida de expresión de ARNm de PIGH de los subcultivos negativos a anclaje GPI era resultado de delección genómica de las 10 kb de PIGH , se realizó la PCR utilizando cebadores diseñados para amplificar la región genómica completa; también se realizó secuenciación de Sanger de 630 pb de la región promotora del gen PIGH. Y en ambos casos no se detecto delecciones, inserciones o mutaciones genómicas.

5. Mediante análisis de curva de fusión específica de metilación (MS-MA) y secuenciación de Sanger se mostró altos niveles de metilación en la región (CpG −11 a −6), lo que implicaría  que los CpG en esta posición son esenciales para la regulación de la transcripción PIGH.

6. Se trató a los subcultivos negativos de anclaje GPI con el agente desmetilante 5-aza y se observó el restablecimiento de la expresión de anclaje GPI.

RESULTADOS:

La presión selectiva proporcionada por el tratamiento con ALM puede dar lugar al crecimiento de variantes de escape GPI / CD52 negativas en pacientes con LLA-B, debido a que la pérdida de la proteína CD52 anclada a GPI hace que las células sean resistentes al anticuerpo terapéutico de ALM dirigido a CD52. Esta situación puede revertirse con un tratamiento adicional de 5-aza-2'-desoxicitidina que inhibe a la Enzima Metil-Transferasa de ADN (DNMT), aumentando la efectividad del tratamiento con ALM y reduciendo el alto índice de recaídas.

REFERENCIAS:
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/ajh.25337

Inmunoterapia contra Leucemia Linfoblástica Aguda con células CAR-T

TIPO DE EDICIÓN: Ex vivo- célula somática: linfocito T

DIRIGIDO HACIA: Secuencias ADN para para expresar un Receptor de Antígeno Quimérico (CAR) que no necesite del Complejo Mayor de Histocompatibilidad.

DIRIGIDO POR: CRISPR/Cas9, una vez se produzca el corte en el ADN, la maquinaria celular se encarga de su reparación por el mecanismo de Integración Independiente de Homología (HITI), que permite la expresión del transgen CAR transferido por el virus adenoasociado (AAV). 
ÓRGANO A TRATAR: Principalmente sangre donde interactue Linfocito CAR-T con B, podría ocurrir también en linfa.

VÍA DE ADMINISTRACIÓN: Infusión intravenosa

RESULTADOS A CORTO, MEDIANO Y LARGO PLAZO:

Este modelo de terapia resulta prometedor en el caso de linfoma y Leucemia Linfoide Aguda, puesto que las células CAR-T  muestran especificidad por CD19, un antígeno CD que actúa como co-receptor en células B, no obstante, hay posibilidad de que se presenten efectos adversos como tormenta de citocinas, neurotoxicidad o Síndrome de Activación de Macrófagos.  

REFERENCIAS:

http://uvadoc.uva.es/bitstream/handle/10324/36294/TFG-M-1363.pdf?sequence=1&isAllowed=y

https://www.sjdhospitalbarcelona.org/es/oncologia/inmunoterapia-cart19

Terapia Regenerativa en Leucemia Linfoide Aguda

El trasplante de progenitores hematopoyéticos alogénico (alo-TPH) ofrece a los pacientes con leucemia linfoblástica aguda (LLA) con alto riesgo de recaída mejores resultados de supervivencia respecto a la quimioterapia convencional. Los pacientes candidatos para un trasplante tienen un pronóstico genético desfavorable o persistencia de la enfermedad medible residual (EMR) después de la primera remisión. Los progenitores hematopoyéticos se obtienen de la médula ósea  [MO], sangre periférica [SP] o sangre de cordón umbilical [SCU]. La fuente preferida para los pacientes pediátricos es la MO, por su menor incidencia de EICR crónico y MRT a largo plazo respecto a SP, misma que se administra por catéter venoso.  En la edad pediátrica el impacto de la EMR previa al trasplante ha sido demostrado, observándose una Supervivencia Libre de Enfermedad (SLE) del 20% en los pacientes con EMR > 10 ⁻⁴ y un 74% en aquellos con EMR indetectable por citometría de flujo; razón por la que se plantea la necesidad de utilizar tratamiento de inmunoterapia pre-TPH, que podría disminuir la EMR y conseguir así mejores resultados post-TPH. Respecto a la EMR post-TPH, se ha demostrado su utilidad como factor predictivo de recaída. 

REFERENCIAS:

https://www.clinicalkey.es/#!/content/playContent/1-s2.0-S0025775319300636?returnurl=https:%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS0025775319300636%3Fshowall%3Dtrue&referrer=

Uso de animales y plantas transgénicas para producción de Anticuerpos Monoclonales como alternativa terapéutica de Leucemia Linfoide Aguda

Los anticuerpos monoclonales son aquellos que reconocen de forma específica un único epítopo, desencadenando la respuesta inmunitaria humoral encargada de su destrucción; dichos anticuerpos monoclonales se origina de un solo clon de linfocito B tanto en seres humanos como en animales. En base a este principio, se inicio la producción de anticuerpos inyectando antígenos en ratones, sin embargo su vida media en cultivo in vitro era sumamente corta, razón por la que se empleo la técnica de hibridoma en murinos a partir de 1975. Lamentablemente el uso de estas moléculas se ve limitada por la reacción inmunológica del ser humano ante sustancias de origen animal, problemática que ha sido solventada por la ingeniería genética al emplear los animales anteriormente mencionados y plantas transgénicas como Lemma minor y Arabidosis thaliana, portadores de Ig humanas. 

Ventajas

1. Producción de sustancias eficientes tales como anticuerpos monoclonales con una vida promedio    larga para fines terapéuticos contra cáncer, asma y enfermedades autoinmunes.

2. Emplear plantas aumenta la productividad y reducción del costo, por lo que esta alternativa        terapéutica puede ser más accesible.

3. Utilizar transgénicos reduce la respuesta inmune ante sustancias terapéuticas de procedencia a      animal.

4. Los animales transgénicos, generalmente knock out, han sido excelentes modelos de investigación respecto a reconocimiento de genes involucrados en el desarrollo de cáncer u otras enfermedades en los seres humanos.

5. En base a modelos de animales transgénicos se puede realizar investigación sobre alternativas terapéuticas previo a su uso en seres humanos.

Desventajas

1. Las sustancias producidas en animales transgénicos pueden sufrir alteraciones fisiológicas, por lo que se debe realizar un exhaustivo estudio de investigación antes de su comercialización.

2. Escaso desarrollo científico y tecnológico en varios países, condiciona la capacidad del gobierno de garantizar la seguridad de la población al permitir la administración de estas sustancias.

3. Políticas restrictivas para su uso e investigación en Ecuador, inducido por la presión del sector agrícola y ganadero.

4. Alto costo y demanda de talento humano.

5. Alteración de la biodiversidad natural en plantas y animales empleados para estos estudios científicos.

REFERENCIAS

https://riull.ull.es/xmlui/bitstream/handle/915/12352/Anticuerpos+monoclonales+terapeuticos.pdf?sequence=1

http://www.medisur.sld.cu/index.php/medisur/announcement/view/528

http://dspace.udla.edu.ec/bitstream/33000/8165/1/UDLA-EC-TPE-2017-22.pdf

ADN recombinante artificial en Leucemia Linfoide Aguda

A pesar de que la terapia génica en LLA con líneas celulares del paciente esta en auge de investigación, desde la década de los 80`s se ha incursionado en la producción de proteínas recombinantes tales como inmunomodulares. La interleukina-2 (IL-2) fue descubierta en 1976 y su gen, ubicado en el cromosoma 4 que genera un polipéptido de 153 aminoácidos, fue clonado en 1984, por transformación del vector a una célula E. coli K12. Desde entonces se desarrollaron múltiples ensayos clínicos que demostraron la actividad antitumoral de IL-2 siendo utilizada en quimioterapia y posteriormente se pensó que la IL-2 podría erradicar la enfermedad mínima residual tras un Trasplante de Médula Ósea (TMO), para ello se analizó satisfactoriamente la tolerancia al régimen de tratamiento, efectos inmunológicos, pero no aumento la supervivencia libre de enfermedad de pacientes con neoplasia linfoide en remisión completa con alto riesgo de recaída.

REFERENCIAS 

http://www.analesranf.com/index.php/mono/article/viewFile/535/553

https://core.ac.uk/download/pdf/13322906.pdf#page=28

https://repositorio.unican.es/xmlui/bitstream/handle/10902/11636/Fernandez%20Vecilla%20Domingo.pdf?sequence=4&isAllowed=y

Recombinación de ácidos nucleicos en la naturaleza

Actualmente el mundo vive un proceso alarmante debido a enfermedades reemergentes, aquellas que reaparecen después de décadas, y enfermedades emergentes relativamente nuevas a causa de virus o agentes acelulares infecciosos que han sufrido un proceso de evolución, variabilidad genética, por recombinación y mutación genética. Así aparecen enfermedades como el Dengue, la gripe aviar, la fiebre amarilla, el Zika, la fiebre hemorrágica de Crimea-Congo, el Ébola, la fiebre del valle del Rift y del Nilo, etc. La recombinación sucede generalmente cuando dos virus han infectado la misma célula al mismo tiempo, aquí intercambian regiones similares de sus genomas virales ya sea ADN o ARN, o redistribuyen fragmento que sean diferentes.

REFERENCIAS

http://e-spacio.uned.es/fez/eserv/bibliuned:revista100cias-2016-numero9ne-5115/Virus_emergentes.pdf

https://es.khanacademy.org/science/biology/biology-of-viruses/virus-biology/a/evolution-of-viruses

MICRORRAY, RT-PCR Y NORTHERNBLOT: INVESTIGACIÓN SOBRE LA REGULACIÓN DE miRNA`s POR ACCIÓN DE GLUCOCORTICOIDES (GC)

Para analizar la eficiencia del tratamiento, se estudiaron muestras de 13 niños con ALL sometidos a monoterapia con GC sistémica. Las matrices Exon y U133 detectan transcripciones primarias de genes que contienen miRNA, sus transcripciones poliadeniladas y pre-miRNA procesados ​​por Drosha. Para determinar si su expresión se reguló después de 6 h y / o 24 h de exposición a GC, se emplea RT-PCR en tiempo real y experimentos de transferencia Northern, identificando que GC aumentan la expresión del gen que codifica miR-223 (DQ680071) y SMC4, que contiene miR-15b y -16-2 en uno de sus intrones. Estos miRNA`s inducen apóptosis, pues su objetivo es inhibir la expresión deBCL2 y BCL-XL. Hasta la actualidad se estudia la función de los miRNA`s en la regulación de genes que cofican o no proteínas que promueven la eficiencia de los fármacos.

REFERENCIAS 

https://www.nature.com/articles/leu2008370#MOESM45

Umerez M, Thesis IP. MiR-Pharmacogenetics in Childhood Acute Lymphoblastic Leukemia

Treatment. 2018. Disponible en: https://addi.ehu.es/handle/10810/32356